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Il sito ci era stato segnalato dal Prof. Salvatore di Giulio che ringraziamo per la gentilezza e competenza.

Meccanismi di Resistenza del Biofilm ad Agenti Antimicrobici

I Biofilm contrastano le azioni degli antimicrobici mediante molteplici meccanismi. Questi si possono ricondurre a tre ampie categorie:

- Riduzione della concentrazione di antimicrobici nella massa fluida che circonda il biofilm

- Inefficacia dell’agente antimicrobico nel penetrare il biofilm

- Adozione di uno stato di di resistenza fisiologica di almeno una parte delle cellule del biofilm

Nel primo caso l’angente antimicrobico è reso inefficace prima di raggiungere il biofilm. Nel secondo caso, l’agente antimicrobico è trasportato fino alla superficie del biofilm ma non penetra nello stesso. Nel terzo scenario l’agente antimicrobico attraversa la superficie del biofilm ma non è in grado di eliminare i microrganismi in quanto si trovano in uno stato fenotipico che conferisce loro una ridotta suscettibilità. Di quest’ultimo scenario distinguiamo due versioni:

1. Una carenza di nutrienti porta ad una lenta crescita batterica o a regioni con ridotta concentrazione di nutrienti nel biofilm.

2. Presenza di una intrinseca mutazione fenotipica nel biofilm che non dipende dalla carenza nutrizionale.

Questi meccanismi di protezione del biofilm non si escludono tra loro., sembra infatti che combinazioni dei tre tipi di resistenza suddetti lavorino in parallelo.
La ridotta suscettibilità del biofilm non è stata attribuita agli abituali meccanismi (mutazione o acquisizione di elementi genetici che attivino una specifica resistenza genetica) che possano spiegare la resistenza agli antibiotici convenzionali. In base a questi meccanismi, per spiegare la resitenza del biofilm, le modificazioni genetiche dovrebbero essere presenti nel biofilm, ma essere assenti nello stato plactonico. Questo non sembra avvenire nella generalità dei casi. Sebbene chiaramente suscettibili, i microrganismi, acquisiscono una marcata resistenza sviluppandosi nel biofilm, infatti, quando allontanati da un biofilm questi microrganismi tornano rapidamente ad uno stato di suscettibilità.

1. Deplezione di antimicrobici nella massa fluida

Se un biofilm esercita una azione di tipo chimico su un agente antimicrobico con il quale sta interagendo, allora è possibile ridurre, per queste azioni neutralizzanti, la concentrazione dell’agente nel fluido. Si consideri ad esempio un test di sensibilità antimicrobica fatto prima su una sospensione diluita di cellule plankton e poi su biofilm altamente sporchi. Non è difficile immaginare che la concentrazione di agenti antimicrobici possa essere mantenuta durante il test con il plankton ma diminuisca significativamente durante il test con il biofilm. Si potrebbe argomentare che questo fenomeno non sia dovuto ad un vero e proprio meccanismo di resistenza ma semplicemente ad un confronto non appropriato. Il biofilm non è sottoposto alla stessa concentrazione di agenti antimicrobici del test fatto con il Plankton. Sembra che questo ovvio meccanismo sia stato spesso trascurato. Potrebbe valere la pena di considerare la diminuzione di agenti antimicrobici nel fluido come una possibile spiegazione della scarsa performance antimicrobica sulla pellicola di biofilm. La diminuzione di agenti antimicrobici in un fluido può essere diagnosticata sperimentalmente misurando le concentrazioni residue di agenti antimicrobici durante i test sul plankton e sul biofilm. In alcuni sistemi sperimentali è possibile misurare il potere disinfettante sia sul plankton che sul biofilm nello stesso fluido, approccio che elimina elegantemente la possibilità di un trattamento con eguali concentrazioni.

2. Transport Limitation of Antimicrobial Penetration

La seconda e più plausibile versione della limitazione del trasporto di antimicrobici nei biofilm richiede un’interazione tra l’agente antimicrobico e il biofilm che ne neutralizza l’attività. La barriera alla penetrazione in questo caso è reattiva piuttosto che fisica; la percentuale di disattivazione dell’antimicrobico supera la percentuale di penetrazione di tipo diffusivo. Questo meccanismo è supportato sperimentalmente in caso di ipoclorito (de Beer et al, 1994; Chen and Stewart, 1996; Xu et al, 1996), ed è verosimile essere importante per altri ossidanti altamente reattivi come l’ozono e l’acqua ossigenata, e può essere allo stesso modo un fattore per alcuni biocidi non ossidanti(Stewart et al, 1998). É anche realistico per alcuni antibiotici come i beta-lattami, che sono soggetti ad una rapida degradazione enzimatica.

3. Limitazione fisiologica dell’efficacia degli antimicrobici

E’ chiaro che ci sono molte circostanze in cui il biofilm è troppo sottile o insufficientemente reattivo con gli agenti antimicrobici per manifestare l’uno o l’altro dei meccanismi di resistenza di cui sopra. In questi casi la ridotta suscettibilità dei microrganismi del biofilm trova spiegazione da un punto di vista biologico. Noi preferiamo distinguere due tipologie generali di limitazione biologica della suscettibilità del biofilm. Il primo tipo di limitazione biologica alla suscettibilità del biofilm richiede che almeno alcune delle celle del biofilm siano soggette ad una limitazione dei nutrienti, e perciò manifestino una lenta crescita o si trovino in uno stato di sofferenza. Si è ipotizzato (o dimostrato sperimentalmente) che questa lenta o inesistente crescita cellulare riduca la suscettibilità a molti agenti antimicrobici.

Il secondo tipo di limitazione biologica alla suscettibilità del biofilm si rifà all’esistenza di un distinto e relativamente resistente fenotipo del biofilm. Questo fenotipo non è la conseguenza di una limitazione dei nutrienti. L’ipotizzato fenotipo del biofilm è adottato da un substrato della popolazione microbica nel biofilm come risultato di altri stimoli, per esempio contatto con una superficie solida o il raggiungimento dell’inizio di una densità cellulare.

L’eterogenicità spaziale dello stato fisiologico all’interno del biofilm può essere un elemento cruciale nel determinare la suscettibilità agli agenti antimicrobici. Per illustrare questo punto si suppone che l’azione di un agente antimicrobico sia legata proporzionalmente alla crescita o dipenda dallo stato nutrizionale. Si prendano in considerazione i due distinti scenari, mostrati di seguito, riguardanti il profilo di crescita microbica all’interno del biofilm.

Nello scenario di tipo omogeneo, l’intero biofilm cresce alla stessa velocità che è tuttavia dimezzata dalla crescita del placton. Nello scenario eterogeneo la metà superiore del biofilm cresce al ritmo del placton, mentre la metà inferiore non cresce affatto. La velocità di crescita media è la stessa in entrambi i casi cioè la metà della velocità di crescita del placton. É presumibile che la risposta ad un agente antimicrobico che influenzi la velocità di crescita sia estremamente diversa in questi due scenari come mostrato a destra.

La parte superiore del biofilm eterogeneo, quella soggetta alla crescita sarà eliminata ma la metà la cui crescita si è arrestata (ma ancora vitale) è difficile da eliminare. La massima eliminazione possibile nel biofilm eterogeneo è perciò il 50% che corrisponde ad una riduzione in scala logaritmica di circa 0.3. Il biofilm omogeneo può essere completamente eliminato, quantunque ad una velocità pari alla metà di quella di eliminazione del placton

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